ViralStarsTM LP
Lentivirus Packaging Kit
Catalog Number：LP110
01/產品概述
慢病毒是一種有包膜的RNA病毒，直徑為80-120 nm，呈二十面體對稱結構、球形。病毒顆粒最外層是包膜（包膜蛋白決定了感染細胞的類型），再往里依次為基質蛋白和衣殼，最里面是兩條相同的正股RNA鏈和酶（逆轉錄酶、整合酶和蛋白酶）。
慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質?？商峁┌b重組慢病毒載體所需的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接或濃縮后用于宿主細胞的感染。
慢病毒感染細胞的第一步是通過包膜蛋白與細胞表面受體結合。慢病毒與宿主細胞膜融合后釋放結構蛋白、酶蛋白和病毒核心。病毒RNA在逆轉錄酶的作用下逆轉錄并與整合酶形成整合前復合物。整合前復合物進入細胞核后，整合酶催化其整合至宿主基因組。整合后的DNA轉錄為mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白或產生RNAi干擾。
ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit慢病毒包裝試劑盒屬于第二代慢病毒包裝體系，同時可兼容第二代和第三代慢病毒包裝質粒。慢病毒中的毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒，即產生的慢病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒。ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit包裝的慢病毒具有感染效率高、感染譜廣等特點，可實現外源基因在宿主細胞中的穩(wěn)定持續(xù)表達。經該試劑盒包裝獲得的對照質粒病毒滴度可達108 TU/mL。
ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit慢病毒包裝試劑盒包含如下組分：
(1) 優(yōu)化配比的慢病毒包裝輔助質?；旌衔铮≒ackage Plasmid Mix），經過設計調整，可兼容大多數慢病毒表達載體，確保將重組子包裝成具有高感染率的慢病毒顆粒。
(2) 表達GFP 和 Puro標記的對照質粒（Control Plasmid），便于觀察病毒包裝效率及測定病毒滴度。
(3) 高效轉染試劑（PolyShooter Transfection Reagent），具有更高的轉染效率和更低的細胞毒性。
(4) 常用病毒感染增強試劑Polybrene，能夠顯著提高病毒與細胞的接觸及感染效率。
02/產品組分
03/保存條件
冰袋（wet ice）運輸。-20℃ 保存，有效期12 個月。
04/產品特點
* 簡單快速——操作簡單，無需對包裝輔助質粒進行抽提，也無需對包裝體系進行優(yōu)化
* 病毒滴度高——可包裝出高滴度、高表達水平的慢病毒
* 應用范圍廣——經過設計及優(yōu)化配比，兼容大多數慢病毒表達載體
05/實驗流程概要
06/實驗步驟
一、重組慢病毒制備
1. 細胞準備
轉染前一天，將4-6×106 個293T細胞接種到10 cm細胞培養(yǎng)皿中，使其在包裝時密度為70%-80%，放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h～24 h。
? 細胞狀態(tài)會極大影響病毒包裝效率，待包裝細胞應處于良好生長狀態(tài)，建議使用生長處于指數期、存活率大于90% 的細胞進行慢病毒包裝。
? 該包裝系統與ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）配合使用，可包裝出更高滴度、更高表達水平的慢病毒。
2. 慢病毒包裝
(1) 取10 μL慢病毒包裝輔助質粒混合物（Package Plasmid Mix）加入到2 mL離心管中，加入2.5 μg含有目的基因的慢病毒載體質粒，輕輕混合，加入32 μL PolyShooter 轉染試劑與質?；旌希覝胤跤?分鐘。
? 慢病毒載體質粒需根據研究基因自行構建，應使用無內毒素質粒抽提試劑盒進行質粒提取，保證質粒A260/A280比值為1.8-2.0，濃度不低于500 ng/μL。溶解后的質粒切忌反復凍融，需按照使用量進行分裝并于-20℃保存。
(2) 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉染試劑-核酸復合物。
? 轉染試劑-核酸復合物在室溫下4個小時內保持穩(wěn)定。
(3) 將上述1.8 mL轉染試劑-核酸復合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿293T細胞中，輕輕搖動培養(yǎng)皿混勻，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產毒。
3. 收獲病毒
(1) 轉染24 h后，可選擇棄去初始病毒上清液，加入10-15 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)(此步驟可選)。
(2) 轉染48 h后，收集病毒上清液，再加入10-15 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
(3) 轉染72 h后，觀察細胞狀態(tài)并拍照，進行二次病毒上清液收集，與48 h收集的上清液混合，300xg離心10分鐘以除去細胞碎片，使用0.22 μm濾器過濾，過濾后的上清液可直接感染目的細胞，或使用慢病毒濃縮試劑盒(LC110R)濃縮后感染目的細胞。
? 切忌反復凍融病毒，凍融一次病毒滴度將降低10-20%。-80℃保存的慢病毒最好在半年內使用。
二、病毒滴度測定
1. 孔稀釋法標定帶熒光的重組慢病毒滴度
(1) Day1：準備細胞
對生長狀態(tài)良好的293T細胞消化計數后稀釋至?1-3x105個?/mL?，加入96孔板，100?μL/孔（1-3x104個?/孔），每?種慢病毒設6個梯度孔，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(2) Day2：病毒的稀釋與感染
在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)6個稀釋梯度。稀釋方法如下：準備6個?菌EP管，每個EP管中加?90μL 新鮮的*培養(yǎng)基（含10 μg/mL polybrene），取待測定病毒液10 μL加?到第?個EP管中（標記10 μL），混勻后取10 μL病毒稀釋液加?到第?個EP管中（標記1 μL），以此類推，直到稀釋到最后?管。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，并做好標記，??操作，不要吹起細胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。如需設置復孔，則按復孔的數量倍數增加以上用量。
(3) Day3：棄病毒，換液
吸去含病毒的培養(yǎng)基，在每個孔中再加入?100 μL?預熱的新鮮*培養(yǎng)基。
(4) Day4：熒光計數與滴度計算
方法1：末位稀釋計數法
感染36-48 h后，用熒光顯微鏡對熒光陽性細胞進行計數。數出最后兩孔的熒光細胞數(若設置了復孔，則計算復孔內的總數之和并計算出平均數)，假設為A(倒數第二孔的
熒光細胞數）和B（倒數第一孔的熒光細胞數)。
慢病毒滴度計算公式1：病毒滴度 (TU/mL) =（A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μL）
舉例1：5號管對應的熒光陽性細胞數為10個，6號管對應的熒光陽性細胞數為2個，則病毒滴度為：
滴度（TU/mL）=?（?10+2x10）x1000/2/0.001?=?1.5x107
如果需要感染?2x105個細胞，MOI=5（1個細胞對應5個病毒顆粒），則需病毒體積為：
所需病毒體積?=?2?x105x?5/1.5x107（mL）=?0.067?mL?=?67?μL
方法2：適量熒光計數法
感染36-48 h后，用熒光顯微鏡或流式細胞術對熒光比例合適（10%-50%）的連續(xù)兩個梯度進行統計，數出兩孔的熒光細胞數(若設置了復孔，則計算復孔內的總數之和并計算出平均數)，假設為 C（較高濃度孔的熒光細胞數）和D（較低濃度孔的熒光細胞數）。
慢病毒滴度計算公式2：病毒滴度 (TU/mL) =（C+D×10）×1000/2/C孔病毒量（μL）
舉例2：3號管對應的熒光陽性細胞數為10000個，4號管對應的熒光陽性細胞數為2000個，則病毒滴度為：
滴度（TU/mL）=?（?10000+2000x10）x1000/2/0.1?=?1.5x108
如果需要感染?2x105個細胞，MOI=30（1個細胞對應30個病毒顆粒），則需病毒體積為：
所需病毒體積?=?2?x105x?30/1.5x108（mL）=?0.04?mL?=?40?μL
2. 相對定量PCR標定非熒光的重組慢病毒滴度
(1) Day1：準備細胞
對生長狀態(tài)良好的293T細胞消化計數后稀釋至1-3x105個?/mL?，加入24孔板，500?μL/孔（?0.5-1.5x105個?/孔），每?種慢病毒設6個梯度孔，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(2) Day2：病毒的稀釋與感染
在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)6個稀釋梯度。稀釋方法如下：準備6個?菌EP管，每個EP管中加?450μL 新鮮的*培養(yǎng)基（含10 μg/mL polybrene），取待測定病毒液50 μL加?到第?個EP管中（標記50 μL），混勻后取50 μL病毒稀釋液加?到第?個EP管中（標記5 μL），以此類推，直到稀釋到最后?管。棄去24孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，并做好標記，??操作，不要吹起細胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。如需設置復孔，則按復孔的數量倍數增加以上用量。
(3) Day3：棄病毒，換液
吸去含病毒的培養(yǎng)基，在每個孔中再加入?500 μL?預熱的新鮮*培養(yǎng)基。
(4) Day4：相對定量PCR與滴度計算
用PBS清洗并將細胞吹打下來，離心收集細胞，進行基因組DNA的提取，qPCR檢測。以被測慢病毒載體梯度稀釋為標準品，慢病毒載體上的通用引物進行qPCR以獲得病毒整合拷貝數。以Actin質粒梯度稀釋為標準品，Actin引物進行qPCR檢測樣品的基因組拷貝數以得到基因組拷貝數。
慢病毒滴度計算公式3：滴度（IU/mL）=(E×N×1000)/對應孔病毒量（μL），其中E=平均每基因組慢病毒整合拷貝數，N=感染時細胞的數目（約為1.5×105）。
? 測定時，設置一組帶熒光的已知TU的慢病毒作為對照，以校驗檢測出的數值。
三、慢病毒感染目的細胞
VSVG包膜蛋白對不同的細胞和組織的親嗜性有很大差異，在使用慢病毒感染目的細胞之前，需要查閱相關文獻或進行預實驗確定目的細胞的復感染指數（MOI，multiplicity of infection）。
1. 按照上述步驟包裝慢病毒及確定慢病毒滴度，通過病毒滴度和MOI計算所需病毒量（計算公式參考06/實驗步驟/病毒滴度測定）。
2. 實驗前一天，將生長狀態(tài)良好的目的細胞消化計數后稀釋至1-3×105/mL，加入12孔板，1 mL/孔。放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
? 懸浮細胞不需要提前一天接種，實驗前將細胞計數接種后，直接加入病毒混合液即可。
3. 配制慢病毒+polybrene+培養(yǎng)基混合液。polybrene為常用的促感染試劑，能夠顯著提高病毒與細胞的接觸及感染效率，一般使用濃度為2-10 μg/mL，但對某些細胞（如末端分化的神經元，DC細胞等）毒性較大，初次使用建議先做毒性測試。
4. 吸去12孔板中目的細胞的培養(yǎng)基，加入3中配制的慢病毒混合液，放入37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
? 感染懸浮細胞或半懸浮細胞，則需采用平角離心轉染法，即將適量的病毒液加入細胞培養(yǎng)板后，封好口，放入平角離心機中，低速（200xg）離心?1 h?，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
? 若實驗條件有限，沒有平角離心機，可用離心管代替，將細胞吸入離心管中，進行低速離心，去掉大部分上清，加入適量的病毒液，室溫放置?15 min，然后將細胞和病毒液同時吸出轉入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。
5. 病毒感染16 h后更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
6. 病毒感染36-48 h后，熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。
7. 若表達效果不理想，可調整MOI（例如，設置MOI梯度）再次檢測。
07/適用范圍
兼容大多數慢病毒表達載體，經過設計及優(yōu)化配比，確保將重組子包裝成具有高感染率的慢病毒顆粒，同時防止病毒的自我復制。
08/注意事項
1. 該系統與ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）配合使用，可包裝出更高滴度、更高表達水平的慢病毒。
2. 在收獲粗病毒后，建議額外分裝幾支20-100 µL小體積管，和其他分裝的大體積病毒一并置于-80℃保存。待這些小體積病毒結冰后，取出來融化，再測定滴度。這一步可以模擬一次凍融帶來的活性滴度下降，這樣測得的滴度才是真正具有參考價值的。
3. 為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗。
4. 所有慢病毒操作均需在BSL2級生物安全柜中進行。
5. 本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。
09/實驗案例分析
1. 提前一天使用10 cm細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001），待細胞密度為75% 左右開始包裝慢病毒。
2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進行慢病毒包裝。取10 μL慢病毒包裝輔助質?；旌衔铮≒ackage Plasmid Mix）加入到2 mL離心管中，加入2.5 μL表達GFP 的對照質粒（Control Plasmid），輕輕混合，加入32 μL PolyShooter轉染試劑與質?；旌?，室溫孵育3分鐘。
3. 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉染試劑-核酸復合物。
4. 將上述1.8 mL轉染試劑-核酸復合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿慢病毒包裝細胞中，輕輕搖動培養(yǎng)皿混勻，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產毒。
5. 轉染24 h后，棄去初始病毒上清液，加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
6. 轉染48 h后，收集病毒上清液，再加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
7. 轉染72 h后，觀察細胞狀態(tài)并拍照，進行二次病毒上清液收集，與48 h收集的上清液混合后，300xg離心10分鐘以除去細胞碎片，0.22 μm濾器過濾，使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進行20倍濃縮，使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）重懸慢病毒顆粒。
8. 孔稀釋法測定病毒滴度（參考06/實驗步驟中病毒滴度測定方法），使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況，并拍照記錄，實驗結果如圖2所示。
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