PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent

DNA transfection reagent for large scale recombinant protein expression and virus production

CatalogNumber：P09310

01/產(chǎn)品概述

　　PEI是基因轉(zhuǎn)染中常用的高分子載體，同時也是基因轉(zhuǎn)染的“金標準"。PEI轉(zhuǎn)染的原理是帶正電的陽離子聚合物與核酸中帶負電的磷酸基團形成帶正電的復(fù)合物后，再與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，通過細胞胞吞進入細胞。PEI主鏈上每三個原子就含有一個氮原子，因此具有較高的陽離子密度，這對于結(jié)合帶負電荷的核酸分子是非常有利的。在生理pH條件下，PEI部分胺基被質(zhì)子化，隨著體系pH值的降低，PEI剩余的胺基被質(zhì)子化，從而賦予了其出色的核酸結(jié)合能力和質(zhì)子緩沖能力，有利于通過質(zhì)子海綿效應(yīng)從內(nèi)涵體逃逸。但是，PEI高的陽離子電荷密度，導(dǎo)致其嚴重的細胞毒性。同時，PEI25K含有4%-11％的殘留丙酰基，這可能阻礙聚合物主鏈與DNA的有效結(jié)合，影響基因轉(zhuǎn)染效率。因此，針對PEI的研究工作主要聚焦在通過功能化修飾以及脫丙?；?，來提高轉(zhuǎn)染效率、降低細胞毒性。

　　LeapWal PolyShooter NEO-PEI DNA 轉(zhuǎn)染試劑是一種基于分子量25kDaPEI的DNA轉(zhuǎn)染試劑。通過對PEI進行功能改性，NEO-PEI丙酰基*脫落，顯著改善了PEI的基因遞送性能，表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和較低的細胞毒性。PolyShooterNEO-PEI與PEI25000轉(zhuǎn)染試劑相比，具有很多優(yōu)點。包括：

　　1.PolyShooterNEO-PEI為即用型轉(zhuǎn)染試劑，無需配置，可直接用于細胞轉(zhuǎn)染實驗，而PEI25000需要先把水調(diào)成弱酸性助其溶解，溶解后再用NaOH把pH調(diào)至中性，配置過程繁瑣復(fù)雜，容易引入誤差導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定。PEI40000雖然較PEI25000更易溶解，但也同樣存在配置繁瑣，配置過程中容易引入誤差的風險。

　　2.PEI25000含有4%-11%的丙酰基殘留，丙?；鶗柚咕酆衔镏麈溑cDNA結(jié)合，影響轉(zhuǎn)染效果。相較于PEI25000，PolyShooterNEO-PEI丙?；?脫落，因此其性能始終高效如一。

　　LeapWal PolyShooter NEO-PEI DNA 轉(zhuǎn)染試劑是一種功能強大、值得信賴且經(jīng)濟實惠的瞬時轉(zhuǎn)染試劑，廣泛適用于多種細胞系，包括HEK-293、HEK-293T、CHO-K1、COS-1、COS-7、NIH/3T3、Sf9、HepG2和HeLa細胞等。同時，PolyShooterNEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑在大規(guī)模重組蛋白表達和病毒生產(chǎn)等領(lǐng)域有著高效、低毒、穩(wěn)定、可靠等顯著優(yōu)勢。PolyShooterNEO-PEI提供從96孔板到200L生物反應(yīng)器持續(xù)的高表達轉(zhuǎn)染體系，實現(xiàn)從新藥研發(fā)到工業(yè)化生產(chǎn)的輕松過度。與大多數(shù)細胞轉(zhuǎn)染方案相比，使用PolyShooterNEO-PEI既能得到穩(wěn)定的基因表達效率，又可顯著降低轉(zhuǎn)染成本；

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wetice）運輸。4℃保存，有效期6個月。-30℃至-10℃保存，有效期12個月，避免反復(fù)凍融。

04/產(chǎn)品特點

　　易于使用——即用型轉(zhuǎn)染試劑，無需配置，可直接用于細胞轉(zhuǎn)染實驗

　　轉(zhuǎn)染效率高——針對多種類型細胞，均表現(xiàn)出優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率和高重組蛋白表達

細胞毒性低——作用溫和，能更好地實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率與低細胞毒性之間的平衡

　　性能更穩(wěn)定——丙?；?脫落，性能始終高效如一

　　高性價比——既能得到穩(wěn)定的基因表達效率，又可顯著降低轉(zhuǎn)染成本

　　化學(xué)成分明確，不含動物來源成分

05/適用范圍

PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent 廣泛適用于多種細胞系的DNA轉(zhuǎn)染，可應(yīng)用于大規(guī)模重組蛋白表達和病毒生產(chǎn)等領(lǐng)域。本試劑提供從96孔板到200L生物反應(yīng)器持續(xù)的高表達轉(zhuǎn)染體系，實現(xiàn)從新藥研發(fā)到工業(yè)化生產(chǎn)的輕松過度。

06/實驗流程概要

圖1: PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent轉(zhuǎn)染實驗流程圖

07/實驗步驟（以24孔板為例，其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一：轉(zhuǎn)染量度標準）

1:準備待轉(zhuǎn)染細胞

　　貼壁細胞：轉(zhuǎn)染前一天，將消化后的細胞按照每孔0.3-2x10^5個細胞的量進行鋪板，使其在轉(zhuǎn)染時密度為60%-70%。

　　懸浮細胞：轉(zhuǎn)染當天，配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前，在24孔板中進行細胞鋪板，每500µL生長培養(yǎng)基中加入2-5x10^5個細胞。

　　?細胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率，待轉(zhuǎn)染細胞應(yīng)處于良好生長狀態(tài)，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細胞進行轉(zhuǎn)染。

2:準備PolyShooterNEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物

　?。?）取1μg質(zhì)粒加入到1.5mL離心管中，加入2.5μL*PolyShooter NEO-PEI 轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?；旌?，室溫孵育3分鐘。

　　?*PolyShooter NEO-PEI 轉(zhuǎn)染試劑使用量受細胞類型及其他實驗條件影響，通常情況下，DNA（μg）和PolyShooter NEO-PEI 轉(zhuǎn)染試劑（μL）的推薦使用比例為1：2.5。建議初次使用時，可在1：1-1：5的范圍內(nèi)調(diào)整以優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果。

　?。?）往上述混合物中加入100μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基1（與培養(yǎng)體系一致，且無血清無雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

　　?PolyShooter NEO-PEI 轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物在室溫下4個小時內(nèi)保持穩(wěn)定。

　?。?）30分鐘后，往轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物中加入150μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基2（與培養(yǎng)體系一致，且無血清無雙抗）稀釋復(fù)合物。

3:細胞轉(zhuǎn)染

　　棄去細胞培養(yǎng)基，將上述250µL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細胞，轉(zhuǎn)染4-16小時后，給細胞補充新鮮生長培養(yǎng)基500µL/孔。

4:分析轉(zhuǎn)染細胞

　　轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)36-48小時后，可根據(jù)實際情況用熒光檢測法、WesternBlot、RT-PCR、ELISA、流式細胞術(shù)、報告基因等檢測轉(zhuǎn)染效果，或加入篩選藥物進行穩(wěn)定細胞株的篩選。

表一：轉(zhuǎn)染量度標準

08/注意事項

1:核酸質(zhì)量：想要獲得最高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細胞毒性，應(yīng)選用高純度、無菌、無污染、無內(nèi)毒素的優(yōu)質(zhì)核酸。質(zhì)粒中的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵，內(nèi)毒素會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率顯著下降。推薦使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進行質(zhì)粒提取，保證質(zhì)粒A260/A280比值為1.8-2.0。同時，需合理計算質(zhì)粒用量，轉(zhuǎn)染過量的質(zhì)?？赡軙?dǎo)致細胞毒性甚至死亡；

2:細胞質(zhì)量：細胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細胞進行轉(zhuǎn)染；

　　3:細胞密度：建議細胞傳代后12-24h內(nèi)、細胞密度為60%-70%時進行轉(zhuǎn)染。不同的細胞轉(zhuǎn)染實驗，對細胞密度的要求不盡相同。在進行不同核酸或不同細胞系的轉(zhuǎn)染時，需要根據(jù)說明書再次優(yōu)化實驗條件。此外，在實驗過程中保證相同的接種條件，確保實驗數(shù)據(jù)的可重復(fù)性；

　　4:質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑使用比例：對于大多數(shù)細胞系，轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA(μg)與PolyShooteNEO-PEITransfectionReagent(μL)的比例在1：1至1：5之間，推薦比例為1:2.5。想要獲得轉(zhuǎn)染結(jié)果，需要對這一比例進行優(yōu)化，根據(jù)所轉(zhuǎn)染細胞及質(zhì)粒選擇適合的轉(zhuǎn)染比例；

　　5:PolyShooterNEO-PEITransfectionReagent也可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染，但通過我們實驗室的測試，我們認為體系中血清的存在會對轉(zhuǎn)染效果有一定程度的干擾，所以，為了追求更高效的轉(zhuǎn)染效率，我們更推薦使用無血清轉(zhuǎn)染法（即“07/實驗步驟"中敘述的轉(zhuǎn)染方法）；

　　6:由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會抑制陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，因此有必要檢測特殊培養(yǎng)基與PolyShooterNEO-PEITransfectionReagent的相容性；

　　7:為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗；

　　8:本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

09/實驗案例分析

　　1:轉(zhuǎn)染前一天，將圖2所示3種狀態(tài)良好的細胞接種于24孔板，使其在轉(zhuǎn)染時密度為60%-70%。

　　2:按照每孔計量，取1μgGFP質(zhì)粒加入到1.5mL離心管中，PolyShooterNEO-PEI組（圖2上）加入2.5μLPolyShooterNEO-PEITransfectionReagent與質(zhì)粒混合，PEI組（圖2下）加入2.5μLPEI25k與質(zhì)?；旌?。室溫孵育3分鐘后，往混合物中加入100μL無血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

　　3:孵育30分鐘后，往轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物中加入150μL無血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基稀釋復(fù)合物。

　　4:將細胞培養(yǎng)基棄去，加入上述250µL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

　　5:轉(zhuǎn)染12小時后，給細胞補充新鮮生長培養(yǎng)基500µL/孔。

　　6:轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48小時后，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達情況，并拍照記錄，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2:轉(zhuǎn)染細胞48小時后，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達情況

10/其他相關(guān)產(chǎn)品